EOS-1D Mark IV共搭载了45个自动对焦点，其中采用高精度十字型自动对焦感应器的有39点，可谓EOS史上之最。39个自动对焦点均呈十字型配置了善于捕捉被摄体的对应F5.6光束检测横向线条的线型自动对焦感应器，以及对焦精度高对应F2.8光束检测纵向线条的线型自动对焦感应器，实现了高速且精确的对焦。另外，中央对焦点的自动对焦感应器还能够对应最大光圈F4的镜头。因此，当安装最大光圈大于等于F4的镜头（包括与增倍镜组合后，最大光圈降至F4的情况）时，仍可通过十字型自动对焦感应器进行对焦。不仅如此，当镜头与增倍镜组合后，最大光圈即使降至F8，相机仍可通过横向线条检测自动对焦感应器进行对焦。除中央对焦点以外的38点还可在使用最大光圈为F4的EF 17-40mm f/4L USM和EF 24-105mm f/4L IS USM两款镜头时，通过十字型自动对焦感应器进行对焦。此外，最大光圈大于等于F2.8的镜头中，4款远摄镜头安装增倍镜之后会使光圈降至F4，但即便在这种状态下仍可使用十字型自动对焦感应器进行对焦。
EOS-1D Mark IV对全45点的多点自动对焦加以利用，不再是仅手动选择1点，还能按照被摄体或拍摄情况切换自动对焦点选择模式，进一步提高被摄体的捕捉力。比如说，自定义功能“选定对焦点的自动对焦扩展”中可激活选定对焦点周围的自动对焦点，增加自动对焦点的使用数量进行对焦。对于一些动态难以预测的运动被摄体来说，只使用选定的1个自动对焦会难以合焦，而使用自动对焦扩展就会很方便。在“选定对焦点的自动对焦扩展”下选择“45点全区域”，并将自动对焦模式设置为人工智能伺服自动对焦后，自动对焦范围将以所选自动对焦点为中心向周围邻近的最多18个自动对焦点扩展。配合被摄体动作选定的自动对焦点一旦切换到其他的自动对焦点，自动对焦扩展范围也变为以新的自动对焦点为中心。由于追踪被摄体的自动对焦范围比起使用全45点要小一些，因此即使有其他被摄体进入构图中，也能够持续对主被摄体进行跟踪对焦。
通过可选择的自动对焦点功能设置的5种可选择自动对焦点数量能够检测相机方向并自动切换对焦点位置的与方向链接的自动对焦点功能。
EOS-1D Mark IV中除自动选择自动对焦点，自动对焦点的手动选择可在45点、19点、11点、内部9点和外部9点中选择使用。另外，在自定义功能“与方向链接的自动对焦点”中选择“选择不同的自动对焦点”后，会将自动对焦点位置默认为分别在纵向拍摄与横向拍摄中最后选择的对焦点位置。在拍摄时，相机自动检测持机方向，分别以纵向拍摄、横向拍摄时前一次设置的自动对焦点进行对焦。在拍摄前决定好要使用的自动对焦点位置的话，就可以在突然改变构图时迅速进行对焦。此外，还搭载了“定点自动对焦”，按下部分超远摄镜头上的自动对焦停止按钮会缩小自动对焦范围，可以使对焦位置更加精确。
